פרוצדורה פולשנית ללקיחת דגימה מרקמה הנחשדת כסרטנית. בהקשר לסרטן הערמונית מדובר, בדרך כלל, בדגימות מהערמונית עצמה באמצעות מספר מחטים חלולות. אם יש חשש לגרורות, אפשר לעשות ביופסיה גם באזורים אחרים, כגון מבלוטות לימפה אבל זה נדיר.

יש היום (2022) שני סוגי ביופסיה של הערמונית: דרך פי הטבעת (ראו ערך TRUS biopsy) או דרך הפרינאום (חיץ הנקבים) (ראו ערך Perineal biopsy). עד לאחרונה TRUS biopsy הייתה הדרך המקובלת יותר, אבל בזמן האחרון הדרך השניה, Perineal biopsy, מתחילה להיות מועדפת, בעיקר החשש מזיהום מחיידקי צואה, וגם עקב האפשרות להגיע לאזורים הקדמיים בערמונית שלא היו נגישים למחטים שהוחדרו דרך המעי (ראו ערך Saturation biopsy).

הדגימות מהביופסיה נבדקות ע"י פתולוג, שמזהה רקמה סרטנית ע"י השוואת צורת התאים הנבדקים לצורות ידועות של רקמות סרטניות ואם יש צורך, ע"י הכתמת התאים לזיהוי חלבונים האופייניים לסרטן. על הפתולוג לדווח בכתב על שלושה דברים לפחות:

(1) על מספר המחטים שבהן זוהו תאים סרטניים ועל מיקומן בערמונית.

(2) בכל דגימה, על אחוז הרקמה הסרטנית מכלל נפח הדגימה

(3) בכל רקמה המוגדרת סרטנית, את כמות הסרטן מסוג גליסון 3, גליסון 4 וגליסון 5. על החשיבות של הסיווג לפי גליסון ראו ערך Gleason grade.

הביופסיה נחשבת ל"חותמת הסופית" באבחון סרטן הערמונית ועד היום (2022) אין תחליף לדיאגנוזה, באמצעותה. אבל, יש להבין את המגבלות של הביופסיה. תוצאה חיובית היא כמעט תמיד אמיתית (true positive) אבל קביעת דירוג גליסון נתון במידה רבה למיומנות ולניסיון של הפתולוג ולכן מומלץ דרך קבע לשלוח את הדגימות לפתולוג מומחה לסרטן הערמונית לדעה שניה. כמו כן, אין לדעת בוודאות שהדגימה בעלת דירוג הגליסון הכי גבוה מייצגת את בסרטן הפולשני ביותר בכל הערמונית. מאותה סיבה, ביופסיה שלילית איננה מבטיחה שאין סרטן , שכן אין ביופסיה שבוחנת כל תא ותא בערמונית. משתי סיבות אלה מומלץ לבצע ביופסיה אחרי בדיקת MRI, כי בדיקה זו יכולה לכוון את המחטים לאזורים חשודים ובכך להקטין את הסיכוי לפקשש סרטן פולשני (false negative).